在疫苗生產(chǎn)、生物制藥，細胞免疫，Car-T，以及基礎科研過程中的細胞培養(yǎng)試驗，支原體污染的預防和祛除，是保證生產(chǎn)質(zhì)量和實驗順利的重要環(huán)節(jié)。

往期文章，已經(jīng)為大家介紹了『支原體檢測』的常規(guī)方法，其中包括熒光定量PCR方法的檢測試劑盒，以及可做方法學驗證的標準品等。

本期文章，我們將進一步、多角度的介紹『支原體祛除和預防』的常見簡便方法，希望對疫苗生產(chǎn)、生物制藥、細胞學研究等項目的質(zhì)檢質(zhì)控有所幫助。

關于整個細胞培養(yǎng)過程中支原體祛除與預防，我們將從以下三個方面展開：

一、工作區(qū)域中支原體祛除與預防

支原體可以說是“無處不在"，稍有不慎，環(huán)境中那些對細胞有害的支原體，很容易污染培養(yǎng)體系。

因此，應將支原體的清除與預防，日常實驗室工作區(qū)域的清潔、維護過程中。

除了正確穿戴實驗防護用具外（如：口罩、細胞培養(yǎng)室專用實驗服、鞋套等），還應定期*清潔工作區(qū)域：用新捷爾滅等稀釋液進行墻面、地面的噴灑和擦拭。對于桌面、實驗臺面以及擺放了儀器設備的地方，應選用針對性更強的支原體祛除預防試劑。

Minerva Biolabs Mycoplasma-off™就是一個不錯的選擇。該噴霧劑/濕巾中含有支原體專用殺除劑Mynox®，可在幾分鐘內(nèi)迅速殺除支原體，而且對葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、牛腹瀉病毒、腺病毒、多瘤病毒、鼠諾如病毒、牛痘病毒、真菌孢子等微生物也有比較好的清除效果。

Mycoplasma-off™安全性高，沒有腐蝕性和致癌性成分，相比起其他消毒成分，將人體和實驗儀器設備的消毒風險降至更低。

即用型消毒液，可以快速簡單地保持工作區(qū)的清潔干凈。

二、細胞培養(yǎng)體系中支原體祛除與預防

在進行細胞培養(yǎng)實驗時，如果發(fā)現(xiàn)細胞生長緩慢、甚至大量漂浮、細胞培養(yǎng)液提前變黃等情況，請務必警惕，有可能就是中了支原體的招。

對于珍貴的細胞株，我們往往希望可以拯救一下，首先可以用PCR/qPCR方法檢測細胞是否被支原體污染。

如細胞株已發(fā)生污染，采取以下三種方法處理，能在盡可能短的時間，高效祛除支原體，并有一定的預防能力：

1、Zell Shield®支原體祛除劑（培養(yǎng)基用）

適用范圍

• 細胞已發(fā)生支原體污染，但又不愿丟棄，希望繼續(xù)培養(yǎng)（如已轉染或大量擴增的細胞）。

• 初始培養(yǎng)的原代細胞。

• 存在支原體污染高風險的細胞。

用法

• 1:100加入培養(yǎng)基。

• 當細胞存在支原體污染時，應先對細胞懸浮沖洗三次，再用含Zell Shield®培養(yǎng)基培養(yǎng)。每次傳代前都應做懸浮沖洗處理。連續(xù)傳代4次，支原體即可祛除。

2、Mynox® Gold支原體祛除劑（珍貴細胞保種用）

適用范圍

被支原體污染的珍貴細胞或不易獲得的生物樣本（如細胞種子）。

用法

• 將「首CI治療液」加入到4.5ml培養(yǎng)基（FBS需≤5%）中，培養(yǎng)細胞（細胞數(shù)為104~105）。

• 細胞長至80%-90%匯合時，細胞傳代。將1管「鞏固防護液」加到9.5ml培養(yǎng)基中，用該培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

• 重復步驟2，細胞再傳代2次，支原體即*祛除。

注意：每次傳代時，最好都能把細胞懸浮沖洗三次，可取得更好的治療效果。

3、Mynox®支原體祛除劑（珍貴樣本用）

適用范圍

被支原體污染的珍貴細胞、不易獲得的生物樣本或病毒收獲液（特別是不能長期培養(yǎng)的樣品）。

用法

對于貼壁細胞：

• 培養(yǎng)皿中加入200μl Mynox®和 2.8ml培養(yǎng)基中（FBS≤5%），混勻。

• 再加入2ml細胞（細胞數(shù)為10^4~10^5，培養(yǎng)基中的FBS需≤5%）。

• 細胞培養(yǎng)2小時，棄上清，換用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)4代即可。

對于懸浮細胞：

• 在離心管中加入200μl Mynox®和1.6ml胰酶（0.125 %，5 mM EDTA in PBS），混勻。

• 加入1.6ml細胞（細胞數(shù)為10^4~10^5）。

• 室溫靜置30min。

• 低速離心5min。棄上清，換用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)4代即可。

三、水浴鍋、水箱等支原體祛除與預防

水浴鍋、細胞培養(yǎng)箱中的水槽，也容易變?yōu)楦黝愇廴咀躺臏卮病１３炙鄣臐崈?，對細胞培養(yǎng)的順利進行非常重要。因此在進行清潔時，不要忘記水浴鍋、水槽等地方。

這里推薦大家使用支原體祛除劑（水槽用）——Water Shield™。

Water Shield™可持續(xù)作用4周，使水源避免受到支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子的污染。且不含醛類或疊氮化物，對細胞無毒害。

使用起來也十分便捷，Water Shield™與無菌水按1:200比例，直接加入水中，使用方便，使用后不產(chǎn)生水垢